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Enzymkinetik


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Die Enzymkinetik ist ein Fachbereich der Biochemie. Sie wie schnell und effizient chemische Reaktionen verlaufen bei denen biologische Katalysatoren - die Enzyme - wirken. Da die Enzymkinetik die chemischer Reaktionen beschreibt ist sie ein Teilgebiet chemischen Kinetik und - wegen der Stoffumsetzungen - Chemie . Da jedoch Enzyme und meist auch biologische Substrate (Reaktionspartner) - darunter solche die im Menschen auftreten - untersucht werden gehört sie zur Biologie und zur Medizin .

Ein Hauptziel der Enzymkinetik ist die der Konzentrationsabhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit mit geeigneten Formeln sowie die Bestimmung dazugehörigen Parameter für ein bestimmtes Protein ( Enzymaktivität und katalytische Effizienz ). Da Enzyme dazu dienen Reaktionen zu und zu lenken ist die enzymkinetische Analyse Verständnis von Enzymfunktionen unerlässlich.

Der klassische Weg der Charakterisierung von Enzymen erfolgt aufgrund der Substrataffinität (reziprok zum Km-Wert ) und der Wechselzahl (molekulare Aktivität V max auch kcat genannt): je größer kcat je kleiner Km desto größer die katalytische Effizienz (´kcat-über-Km´-Kriterium; vergl. Abb. "Hyperbel" zur graphische Zur Bestimmung dieser Werte dienen darüber hinaus Verfahren wie die nichtlineare Regressionsanalyse oder - herkömmlich - graphische Extrapolationsverfahren

Inhaltsverzeichnis

Direkt-lineare Auftragung

Wenig verbreitet ist die Tatsache dass enzymkinetische Parameter bequem und präzise direkt aus Sättigungshyperbel gemäß Abb. herleiten lassen (´direkt-lineare Auftragung´ ´Cornish-Bowden-Diagramm´ gegenannt). Hierfür überträgt man die Anfangsgeschwindigkeiten des enzymatischen Umsatzes direkt in ein vs. [S]-Diagramm. Die [S]-Werte sind vor Versuchsbeginn (eingestellte Substratkonzentrationen); während der Versuchsreihe ist dann Ordinatenwert für v (d.h. die Anfangsgeschwindigkeit) nachzutragen. Gegensatz zu normalen Auftragungen werden die Messwerte nicht als Punkte dargestellt sondern in Form Linien die sich im günstigsten Fall in gemeinsamen Punkt schneiden aus dessen Koordinatenwerten Km V max folgen.

Die Fehlerbehanlung wird im direkt-linearen Plot vereinfacht: die Linien im zweiten Quadranten werden oder weniger um einen Punkt streuen. Mittelwertsbildung dann die wahrscheinlichen Werte für die Parameter und V max . Bei Inspektion der Streubreite der Messpunkte identisch mit deren Standardabweichung ) können Ausreißer leicht identifiziert und sog. abgelesen werden.

An dieser Stelle sei erwähnt dass (auch die nachfolgenden) Auswertungverfahren nicht nur für sondern auch für die Bindungsvorgänge von Carriern Rezeptoren Gültigkeit haben. Historisch gesehen gab es zweifellos Parallelentwicklungen (Hanes und Eadie-Hofstee Auftragung für Scatchard und Hill Auftragungen für Carrier).

Linearisierungsverfahren

Klassisch sind zum gleichen Zweck die Diese sind zwar einprägsam und verbreitet zur jedoch mehr oder weniger ungeeignet. Deshalb sollen hier nur gestreift werden:

Lineweaver-Burk Diagramm (doppelt-reziproke Auftragung)

1/v als Funkt. von 1/[S] .
zur Datenrepräsentation meist verwendet zur Auswertung am wenigsten verläßlich. Kleine Fehler in v bei kleinen [S]-Werten eine große Abweichung in bei großen [S]-Werten ist diese eher zu Die Autoren der Methode haben die Unsicherheit 1/v Werte betont und darauf hingewiesen dass grundsätzlich geringer zu gewichten sind. Spätere Anwender dies zumeist ignoriert. Wo möglich sollte dieses zur Bestimmung enzymkinetischer Parameter ersetzt werden vorzugsweise das Hanes Diagramm.

Eadie-Hofstee Diagramm

- verdient eine Mittelstellung
v als Funkt. von v/[S] .
Der Fehler wächst mit v/[S]. Da bei beiden Koordinaten eingeht konvergieren alle Abweichungen Ursprung. Das

Scatchard-Diagramm

v/[S] als Funkt. von v .
gleicht dem vorigen (Achsen sind vertauscht) wird zumeist zur Repräsentation von Bindungsmessungen (anstelle Daten) angewendet. Scatchard- und Eadie-Hofstee Diagramme gelten die besten Werkzeuge zur Diagnose kooperativer Phänomene. Im Falle negativer Kooperativität oder isolierter Bindungsplätze entsteht ein konkaver Verlauf mit Endast. Die Steigungen entsprechen hier den Affinitäten bzw Km) und die Gesamtzahl der Bindungsplätze Zentren) ist aus dem Schnittpunkt mit der abzulesen.

Hanes(-Wilkinson) Diagramm (Hanes-Woolf Diagramm)

[S]/v als Funkt. von [S] .
Bestmögliche Auftragung dieses Typs. Fehler in sind eine weit bessere Annäherung der Fehler v. Aufgrund einer unverfälschten Spreizung der Messpunkte der [S]-Achse wird das Ergebnis durch einzelne prinzipiell weniger verfälscht. Nur bei dieser Auftragung auch eine Datenoptimierung durch lineare Regression sinnvoll sein. Km ist direkt ablesbar.

Hill-Diagramm

Graphische Methode vorrangig für die Bestimmung Kooperativität Bindungsvorganges für ein Protei (Enzym). Gebunden Substrate S (bzw. Liganden L) Die Graphik Kenntnis von Vmax (bzw. n) voraus. Die von
log v/(V max -v) als Funkt. von log [S] bzw.
log r/(n-r) als Funkt. von log [L]
ist eine Gerade der Steigung 1 H = 1) wenn die Bindungsplätze voneinander sind. Bei kooperativen Systemen kann die Steigung am Nullpunkt (der Hill-Koeffizient n H ) theoretisch der Zahl der Untereinheiten (n) wird aber praktisch darunter bleiben. Falls die Km (Kd) Werte nicht durch Tangenten an 45°- Ausläufer der Kurve extrapolierbar sind ist H ein Ersatzmaß der Kooperativität einzusetzen; nur n H = 1 gleicht der Nulldurchgang ln (bzw. ln Kd). Für Hämoglobin (n = das als klassisches hochkooperatives Protein gilt wurde n H zu 2.8-2.9 bestimmt.

Enzymhemmungen

Viele Therapeutika - auch Kampfstoffe - Hemmstoffe oder Mediatoren von Enzymen. Aus diesem ist der Aufklärung des Wirkungsmechanisms immer eine Bedeutung zugekommen. Hier sollte allerdings beachtet werden sich klassische Analysen auf reversibel bindene Stoffe Enzymgifte als "nichtkompetitive Inhibitoren" zu beschreiben ist aber nicht korrekt.

Abgeleitet aus der Michaelis-Menten Gleichung (v = V max x [S] / (Km + [S]) sich die allgemeine Inhibitionsgleichung wie folgt dar:

<math>\nu = 
 \frac { V_{max} \times [S] } Km (1 + \frac{[I]}{Ki}) + [S] (1 \frac{[I]}{Kis}) }
</math>

Danach kann das Verhältnis des Ki-Wertes des Komplexes EI) und des Kis-Wertes (Dissoziationskonstante Komplexes EIS) zur Ableitung des Inhibitionstyps dienen:

A - Mischtyp.

Der Inhibitor bindet sowohl an das freie als auch an den Enzym-Substratkomplex. Km und werden nicht erreicht. Im Sonderfall des nichtkompetitiven wäre Ki=Kis. Km bliebe unverändert aber V max würde nicht erreicht.
B - Kompetitiv.
Der Inhibitor bindet anstelle des Substrats. Km nicht erreicht werden während Vmax mit steigendem angenähert wird. Kis hat keine Bedeutung d.h. unrealistisch groß.
C - Unkompetitiv.
Der Inhibitor assoziiert nur nachdem das Substrat gebunden ist. V max kann nicht erreicht werden währende der scheinbar sinkt(!). Ki hat keine Bedeutung d.h. unrealistisch groß.

Reversible Hemmtypen werden häufig als kompetitiv oder unkompetitiv klassifiziert obgleich sie ursprünglich auf Grundlage von Einsubstratenzymen definiert wurden. Mit Ausnahme kompetitiven Hemmung sind sie jedoch nur für von Bedeutung. Die klassische Vorgehensweise beruht übrigens auf der Inspektion linearisierter Graphiken (s.o.) für der Einfluss eines Inhibitors I auf den bzw Vmax-Wert diskutiert wird. Die Zukunft sollte nichtlinearen Regressionsanalyse auf der Basis der allgemeinen Inhibitionsgleichung




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