Harnoncourt wuchs in Graz auf studierte bei Paul Grümmer und 1948) bei Emanuel Brabec Cello und musizierte als Cellist 1952 bis bei den Wiener Symphonikern.
1953 gründete Nikolaus Harnoncourt gemeinsam mit Frau Alice einer bedeutenden Violinistin das Ensemble "Concentus Musicus Wien" mit Ziel Kompositionen alter Meister der mittelalterlichen Musik der Renaissance- und Barockmusik möglichst im Stil Zeit unter Verwendung von Originalinstrumenten zum Hörerlebnis zu lassen. Den internationalen Durchbruch erzielte das mit einer Aufnahme der Brandenburgischen Konzerte Johann Sebastian Bachs .
1972 bis 1992 unterrichtete Nikolaus Harnoncourt Salzburger Mozarteum Aufführungspraxis und historische Instrumentenkunde.
Seit 1985 werden in Graz Nikolaus gewidmete Klassik-Festspiele die styriarte veranstaltet.
Harnoncourt ist Mitglied in der "Royal Academy of Music" und Ehrendoktor der Universität Edinburgh .
Nikolaus Harnoncourt sammelt historische Musikinstrumente und entwickelt parallel zum Musizieren und auch in musikphilosophischen Schriften seine Analysen der als Klangrede".