Chemisch gesehen ist es eine saure Endopeptidase mit Aspartat als funktionelle Aminosäure im Zentrum die eine Spaltung von Peptidbindungen des mit der Nahrung aufgenommenen Eiweißes katalysiert . Hierdurch werden die Eiweiße in hochmolekulare Peptone aufgespalten. Die beste Wirksamkeit hat Pepsin einem pH-Wert zwischen 1 5 und 3.
Pepsin ist ein Phosphoprotein mit einer von 327 Aminosäuren. Gebildet wird es aus inaktiven Vorstufe dem Pepsinogen unter Einwirkung von Salzsäure durch Autoproteolyse.