RMCE Kassettenaustauschverfahren

Inhaltsverzeichnis

1 RMCE recombinase-mediated cassette exchange 1.1 Gezielter Austausch von Genkassetten 1.2 Referenz 1.3 Weblinks

RMCE recombinase-mediated cassette exchange

Gezielter Austausch von Genkassetten

Die Produktion pharmazeutisch bedeutender Proteine wird über die genetische Modifikation von Säugerzellen erreicht. bedingt Techniken des Gentransfers und die effiziente der genetischen Information ( Expression ) in der Zielzelle. Auf analogen Prinzipien moderne Ansätze zur Gentherapie.

Herkömmliche Verfahren der Modifikation tierischer Zellen wenig zuverlässig nicht zuletzt deshalb weil epigenetische Grundprinzipien noch zu wenig bekannt sind: Gene integrieren nur sporadisch in das Erbmaterial Wirtszelle und wenn sie es tun dann an unpassenden Stellen. Infolgedessen wird das Fremdgen oder nur unregelmäßig abgelesen oder bleibt inaktiv. allem Überfluss lösen sich die neu eingebauten oft wieder aus dem Wirtsgenom heraus die werden instabil.

Hier setzt das RMCE-Kassettenaustauschverfahren an das Vektoren mit Werkzeugen der Hefe versieht:

RMCE-Prinzip: Austausch genetischer Kassetten (´flip´) ermöglicht durch RMCE Rekombinase (´Flp´) der Hefe. Der Einschub FRT-Stellen (Fn) die zu Sätzen zusammengestellt das ermöglichen. Im unteren Teil des Einschubs werden nach konventionellem Transfer (links) und aufgrund von (rechts) dargestellt

In den meisten Hefestämmen gibt es ´2-micron circle´ genanntes Gebilde dessen Überleben durch Rekombinase mit ungewöhnlichen Eigenschaften garantiert wird. Dieses Enzym bewirkt den ´ crossover ´ zweier identischer kurzer Erkennungsstellen (Flp-recombinase targets Halbpfeile in der Abbildung). Das Spektrum der zwischen zwei solchen Stellen ist begrenzt und (je nach der relativen Orientierung) Inversion Deletion oder eine ineffiziente Addition.

1994 wurden Mutanten (Fn) dieser FRT-Stellen hergestellt die untereinander ein effizientes ´crossover´ nach Vorbild des Wildtyps ermöglichen (s. Referenz ). Eines zeigen sie nicht: eine Kreuzrekombination F die zur Deletion führen würde. Damit wir uns in der Situation der Abbildung:

- ein beliebiges Gen (hier ein Selektionsmarker) wird durch einen Satz aus FRT-Stellen und F umgeben; nach seiner Einführung in Genom der Wirtszelle werden die Eigenschaften verschiedener charakterisiert und besonders geeignete Klone isoliert;

- das eigentlich interessierende Gen wird einen entsprechenden Satz an Fn und F (unterschiedlich markierte Halbpfeile) kloniert und als Teil eines zirkulären Vektors die Wirtszelle transferiert. Flp Rekombinase wird nun um einen doppelt-reziproken ´crossover´ zu induzieren. Dies dirigiert nach dem "RMCE- Kassettenaustauschrinzip" das interessierende exakt an den vorbestimmten Ort - ein der sich beliebig oft mit unterschiedlichen Konstrukten lässt.

Dieses Verfahren wird nicht nur für gezielte Konstruktion biotechnologisch bedeutender Zellinien eingesetzt sondern auch zunehmende Bedeutung für die systematische Modifikation Stammzellen z.B. mit der Absicht gezielt transgene zu schaffen.

Referenz

Weblinks

• http://www.uni-protokolle.de/nachrichten/id/18394/
• Thematik im Überblick

Bücher zum Thema RMCE Kassettenaustauschverfahren

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