1875 habilitierte er in Jena im Bereich Zoologie und wurde dort 1878 außerordentlicher Professor. Als Nachfolger von Franz wurde er 1881 an die Universität Königsberg als Professor Zoologie berufen. 1883 wechselte er auf dieselbe Professor an Universität Bonn wo er jedoch nur kurz da 1885 ein Ruf der Ludwig-Maximilian-Universität München erfolgte er bis 1925 blieb und auch als Direktor des Instituts und Leiter der Zoologischen Staatssammlung wirkte.
Zu Beginn seiner Laufbahn machte er Arbeiten zusammen mit seinem Bruder Oskar Hertwig. entwickelten sie 1881 die so genannte Coelomtheorie ein Versuch Erklärung des mittleren Keimblatts die wichtige Erkenntnisse der Embryologie brachte. Sie vermutet dass sich alle und Gewebe verschiedenartig aus drei grundlegenden Gewebeschichten
Hertwig arbeitete systematisch an mehreren Gruppen Wirbellosen und erstellte grundlegende Arbeiten zum Bau Tieren. Am bekanntesten sind seine Beiträge zur Protozoenforschung . Er war auch der erste der Hand des Seeigeleis den Befruchtungsprozeß erstmals richtig als Verschmelzung Ei- und Spermakern erklärte.
Später untersuchte er mit seinen Kindern und Paula noch die Einwirkung von Radiumstrahlen auf tierische Keimzellen.