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NachrichtenLexikonProtokolleBücherForenFreitag, 31. Oktober 2014 

Zellaufschluss


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Als Zellaufschluss werden in der Biochemie Verfahren bezeichnet bei denen Zellen zerstört werden um an deren Inhalt Proteine DNA oder mRNA ) zu gelangen.

Inhaltsverzeichnis

Aufschlussverfahren

Mechanische

Mechanische Aufschlussverfahren führen meist zu einem Temperaturanstieg deshalb muss die Temperatur kontrolliert werden und wenn nötig das im Eisbad gekühlt oder der Aufschluss mit durchgeführt werden.

Tierische und pflanzliche Zellen müssen vor dem Aufschliessen von unerwünschten Gewebeteilen befreit werden indem man sie zunächst Schere Skalpell oder Fleischwolf grob zerkleinert.

  • Tierische und pflanzliche Zellen: Homogenisieren in einem Mixer mit rotierenden (Ultra-Turrax bei kleinem Volumen). Beide Verfahren können
  • Potter-Elvehjem Verfahren wenn die Zellorganellen erhalten bleiben sollen (bewegter Kolben eng von stationärem Gefäss --> Scherkraft)
  • Alle Zellen besonders Mikroorganismen : Bei kleinen Volumina im Mörser mit Sand oder Al 2 O 3 . zerreiben. Glasperlenmühle oder Ultraschall (--> Kavitationskraft Zusammenstoss von Zellen ) für grössere Volumina ( Wärmeentwicklung bei all diesen Verfahren !)
  • Für kontinuierlichen Betrieb oder Volumen >1000ml unter grossem Druck durch ein enges Ventil pressen (Manton-Gaulin Homogenisator)-->Kavitationskraft; Aufschluss unter Druck kleinen Massstab mittels French-Press (gleiches Prinzip wie Homogenisator)

Nicht- mechanische

Nicht- mechanische Aufschlussverfahren werden bei Zellen angewandt welche sich nicht einfach aufbrechen (z.B. Hefe ). Sie sind meist schonender als die mechanischen Verfahren .

Schutz der Proteine

Durch den Aufschluss der Zellen gelangen die Proteine in eine unphysiologische Umgebung und müssen Inaktivierung Denaturierung und Degradation geschützt werden.

pH -Veränderung durch metabolische Prozesse

  • Ausreichende Pufferungung
  • Ggf. Nachstellen des pH-Wertes durch Zugabe Ammoniak- bzw. Tris(hydroxymethyl)aminomethane-Lösung (Tris)

Inaktivierung durch Oxidation von SH-Gruppen

  • Zugabe von Dithioerythritol oder 2-Mercaptoethanol zur Pufferlösung (im mM-Konzentrationen)

Schwermetallionen reagieren mit reaktive Gruppe des Proteins oder divalente Kationen ( Ca 2+ Mg 2+ ) aktivieren abbauende Enzyme

Zu geringe Ionenstärke <0.05M (schlechte Ausbeute da sich Proteine an Zelltrümmer anheften)

Aggregation der Proteine (hydrophobe Wechselwirkungen)

  • Zugabe von nicht- ionischen Detergenzien wie Triton-X-100 (ca. 0.02% w/v) Lubrol PX (ca. 0.006% w/v)

Proteasen werden währen dem Aufschliessen freigesetzt



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